Антибактериальная активность эфирных масел в отношении роста золотистого стафилококка и измерение их взаимодействия в связке с использованием оптических биосенсоров

Антибактериальная активность эфирных масел в отношении роста золотистого стафилококка и измерение их взаимодействия в связке с использованием оптических биосенсоров

Авторы: Чунг, Кьонг-Хван, Ки-Соок Янг, Джин Ким, Джин-Чул Ким и Ки Янг (Корея)

Резюме. В работе была оценена антибактериальная активность эфирных масел (чайного дерева, ромашки, эвкалипта) в отношении роста золотистого стафилококка, а также альгинатных шариков с эфирными маслами.

Взаимодействие в связке между клетками и эфирными маслами измерялось с помощью оптического биосенсора. Антибактериальная активность эфирных масел с клеткой была оценена по взаимодействию в связке и соседстве. Антибактериальная активность проявилась у чайного дерева, ромашки и эвкалипта в порядке убывания по сравнению с эффектом торможения роста клетки при воздействии эфирных масел. Ассоциативная номинальная константа и соседство клетки в связке к эфирному маслу чайного дерева составили 5.0×10-13 мл/(КОЕ•s) и 5.0×105 мл/КОЕ соответственно. Соседство клетки в связке с чайным деревом было в 2 раза выше, чем у других эфирных масел. Возможно, что эффективная бактериальная активность эфирного масла чайного дерева происходит от высокой способности прилипать к клетке, которая выше, чем у других эфирных масел.

Введение
Эфирные масла известны как важные антимикробные вещества, содержащиеся в растениях, и могут также обладать антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Эфирные масла – это сложные смеси соединений, куда входят главным образом моно терпены, сесквитерпены, а также их окисленные производные, такие как спирты, альдегиды, эфиры, кетоны, фенолы и другие. Таким образом, композиция эфирного масла – это баланс различных соединений, хотя у многих видов одна составляющая может преобладать над другой. Продукция, полученная из антимикробных растений, представляет особый интерес из-за устойчивости к антибиотикам, которую приобрели некоторые микроорганизмы. Эфирные масла, полученные из пряностей, лекарственных растений и трав, продемонстрировали свою антимикробную активность и могут быть использованы в качестве антимикробных веществ в борьбе с некоторыми патогенными бактериями. Эфирные масла и их компоненты известны своей активностью в отношении большого спектра микроорганизмов, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии. Исследования показали, что грамотрицательные бактерии демонстрируют большую стойкость к эфирным маслам вследствие наличия липополисахаридов во внешней мембране.

Атопический дерматит является хроническим воспалительным кожным заболеванием, сопровождающимся гиперчувствительной реакцией на обычные аллергены из внешней среды. Бактериальная флора на коже пациентов, страдающих атопическим дерматитом, уникальна, и обычно среди этих бактерий присутствует золотистый стафилококк. Кроме того, известно, что пациенты, страдающие атопическим дерматитом, чаще других заболевают кератоконъюнктивитом, кератоконусом, катарактой и отслоением сетчатки.

Чайное дерево, эвкалипт и другие эфирные масла были сравнительно недавно признаны безопасными и эффективными антисептиками. В лабораторных условиях и клинических испытаниях они продемонстрировали потенциальную антибактериальную активность. Эти масла также используются в качестве терапевтического вещества при лечении атопического дерматита.

Как уже было сказано, масло чайного дерева обладает мощным антибактериальным эффектом. Было установлено в лабораторных условиях, что неразбавленное эфирное масло чайного дерева воздействует на золотистый стафилококк. Однако не совсем ясно почему именно эфирное масло чайного дерева обладает такой мощной антибактериальной активностью против золотистого стафилококка, которая намного превосходит действие других видов эфирных масел.

Поверхностные плазмонные резонансные (ППР) биосенсоры имеют большой диапазон применения, начиная от целевой характеристики, объединенного скрининга и заканчивая оптимизацией для поддержания клинических испытаний, нормативных утверждений и биофармацевтического производства. Такие биосенсоры также позволяют определять взаимодействие макромолекул в режиме реального времени без какого-либо химического изменения лигандов для генерирования сигналов. Связанные молекулы или лиганды ковалентно неподвижны на чипе сенсора, и связывающая молекула захватывается неподвижной лигандой в системе непрерывного потока. В дополнение, может быть также получен количественный анализ молекулярных взаимодействий и кинетических параметров, которые также возможно получить из биосенсорных систем.

С другой стороны, никакие исследования не сообщали об оценке антибактериальной активности эфирных масел на клетки в связывающем взаимодействии при использовании биосенсоров. Данное исследование бактериальной активности на рост золотистого стафилококка сфокусировано на оценке эфирных масел чайного дерева, ромашки и эвкалипта и альгинатных шариков с содержанием эфирных масел. Взаимодействие соединений между клетками и эфирными маслами было определено из результатов кинетических исследований соединений поверхностных плазмонных резонансных биосенсоров. Антибактериальная активность эфирных масел на клетки обсуждается в данной работе вместе с взаимодействием соединений и их соседства.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Микроорганизмы
Золотистый стафилококк был приобретен из корейской коллекции для типового культивирования. Клетки были выращены в течение 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия в питательном бульоне

Реагенты
Были закуплены эфирные масла чайного дерева (Melaleuce Alternifolia, 99,9%), ромашки (Chamaemelum nobile, 99.9%) и эвкалипта (Eucalyptus globulus, 99.9%). Были также закуплены альгинат средней вязкости (3500cps при концентрации 2%) и хлорид кальция. Дифенол-4-4’-дитиол и другие химические вещества были использованы как реагенты без последующей очистки.

Подготовка альгинатных шариков и альгинатных шариков с содержанием эфирных масел
Альгинатные шарики были подготовлены капельным путем из раствора альгината (1%), который при помощи микрофидера был накапан в хлорид кальция при интенсивном помешивании. Подготовленные шарики были вымыты и высушены при комнатной температуре и чистые эфирные масла (400мкл) были смешаны и гомогенизированы при скорости 13500 оборотов в минуту в течение двух минут.

Антимикробный скрининг
Для определения антимикробной активности эфирных масел был использован агар, полученный методом дисковой диффузии. Суспензия золотистого стафилококка (1х108 КОЕ/мл) была распределена на твердых пластинках. Диски из фильтровальной бумаги (в диаметре 6мм) были индивидуально пропитаны 5мкл эфирных масел и помещены на инкубационные пластинки. Пластинки были оставлены при температуре 4 градуса Цельсия на 2 часа после того, как прошла инкубация при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. Диаметры зон ингибирования были измерены и указаны в миллиметрах. Каждый тест был проведен в трех экземплярах и повторен дважды.

Тест на торможение роста в питательном бульоне при помощи эфирных масел
Питательный бульон, используемый для теста на торможение роста клеток, состоит из пептона (5г), экстракта говядины (3г), агара (15г) и дистиллированной воды (1л). Рост золотистого стафилококка (1х108 КОЕ/мл) был остановлен в каждом питательном бульоне (100мл), к которому были добавлены чистые эфирные масла в различной концентрации. Концентрация клеток контролировалась как (1х106 КОЕ/мл), когда шарики с эфирными маслами были введены в бульон. Среда культуры поддерживалась встряхиванием при температуре 37 градусов Цельсия. Рост клеток был оценен посредством измерения всасывания среды культуры при 600нм, используя УФ /VIS спектрофотометр. Рост клеток был оценен по весу сухой клетки, определяемому из калибрирующей кривой веса сухой клетки по отношению к всасыванию при 600нм. Процент торможения роста был определен по формуле:

,

где Abscontrol и Absessential – контрольная абсорбция и абсорбция эфирных масел соответственно при 600нм. В данном исследовании термин «контрольная» означает экспериментальные результаты роста клеток при впрыскивании только клеток.

Анализ загрузки эфирных масел в шарики
Содержание эфирных масел в шариках было проанализировано газовым хроматографом, оснащенным FID детектором и капиллярной колонкой HP1 (внутренний диаметр 0,32мм, длина 50м, толщина пленки 0,17мкм). Вначале мы составили калибрирующие кривые эфирных масел из характерных пиковых областей для эфирных масел с различной концентрацией эфирных масел в этаноле. Шарики с эфирными маслами были растворены в этаноле в течение трех дней при помощи ультразвуковой очистки, а затем раствор была проанализирован методом газовой хроматографии. Рабочие условия для газового хроматографа были следующие: температура инжектора 290 градусов Цельсия FID температуры, температура газа-носителя гелия 250 градусов Цельсия. Температура в печи возрастала с 40 до 250 градусов Цельсия со скоростью 5 градусов в минуту, и самый высокий уровень температуры поддерживался в течение 5 минут.

Оценка привязки снижения роста золотистого стафилококка по отношению к эфирным маслам при помощи анализа ППР
Золотая поверхность чипа ППР сенсора была химически активирована раствором «Пиранья», состоящим из серной кислоты и раствора NaOH, а затем погружена на 2 часа в 0,2% водный раствор цистеамина. Полученная результирующая золотая поверхность была промыта дистиллированной водой и высушена азотом. После погружения золотой поверхности на 1 час в 1,0% раствор дифенил-4-4’ дитиола она была промыта дистиллированной водой, чтобы убрать прилипшие остатки дифенил-4-4’ дитиола с поверхности чипа. Неразбавленные эфирные масла были нанесены слоем на сенсор чипа и высушены при комнатной температуре. Слой эфирного масла, сформированный на золотой поверхности чипа, был оценен посредством измерений откликов ППР.

Золотистый стафилококк был собран посредством центрифуги после инкубации в среде бульона Лурия-Бертани в течение 18 часов. Клетка была промыта и повторно превращена в суспензию до 1х1010КОЕ/мл. Суспензия клетки была введена на слой эфирного масла для ППР анализа с потоком 20мкл в минуту в течение 30 минут. Специфическое взаимодействие между клеткой и эфирными маслами на поверхности сенсорного чипа было зарегистрировано мониторингом значений преломления.

Теория кинетического анализа
Постоянные величины ассоциации и диссоциации рассчитываются по кривой ППР сенсограммы, как описано в других исследованиях. Общее уравнение скорости для бинарной комплексной формулы записывается как:



где [А] и [b] – связь лиганд аналита и поверхности соответственно,
kass – постоянная скорости ассоциации,
kdis – постоянная скорости диссоциации в уравнении (1).

Решение уравнения для скорости образования:



где dR/dt – скорость поверхностного комплексного образования,
R – значение величины RU, отражающей количество связи аналита к неподвижным лигандам на сенсорном чипе,
Rmax – значение величины RU, когда места связывания неподвижных лиганд насыщены аналитом,
С – концентрация аналита в свободном растворе.

Уравнение (2) можно переписать как:



Уравнение (3) может быть выражено как интегральное уравнение (4).



Интегральное уравнение может быть решено с вариацией R как функция от t, как показано в уравнении (5).



где kass, kdis, Cи Rmax – постоянные.

Концентрация аналита С определяется посредством измерения ППР сенсограммы и Rmax, которая может быть получена по результатам оценки ППР сенсограммы.

Постоянные скорости kass, kdis, определяются из результатов наилучшей кривой, подходящей к экспериментальным сенсограммам ППР. Приближение (КА) определяется как отношение kass/kdis.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Альгинатные шарики с эфирными маслами
Были подготовлены альгинатные шарики с эфирными маслами для повышения их эффективности и снижения ненужного распространения эфирных масел. Морфология шариков имеет сферическую форму белого цвета. Размер шариков оценивался по фотографии и был около 4мм. В таблице 1 приведено количество эфирных масел, заполненных в шарики, полученное в результате газохроматического анализа.

Таблица 1. Количество эфирного масла, загруженного в альгинатные шарики



Загруженное количество эфирных масел ромашки и эвкалипта было почти вдвое больше, чем эфирного масла чайного дерева. При этом количество эфирного масла ромашки было немного больше, чем эвкалипта.

Антимикробный диско-диффузионный анализ воздействия эфирных масел на золотистый стафилококк
Результаты антимикробного диско-дуффузионного анализа показаны на рисунке 1.



Рис.1. Фотографии гало-зон, сформированных антибактериальным эффектом эфирных масел, протестированных методом дисковой диффузии.

Показаны эфирные масла (А) Чайное дерево, (В) Ромашка, (С) Эвкалипта.

Результаты показали умеренное торможение активности клеток. Наибольший спектр был обнаружен для эфирного масла чайного дерева. Гало зоны, определенные методом антимикробной дисковой диффузии эфирных масел эвкалипта, ромашки и чайного дерева на клетки составили соответственно 12,0мм, 12,5мм и 13,0мм. Способность к торможению роста у эфирного масла чайного дерева оказалась выше, чем у остальных эфирных масел.

Торможение роста золотистого стафилококка путем впрыска эфирных масел
Вариации концентрации клеток с впрыскиванием эфирных масел в питательный бульон приведены на рисунке 2.



Рис. 2. Вариации концентрации золотистого стафилококка при впрыскивании чистых эфирных масел в 100мл питательного бульона для эфирных масел (А) Чайного дерева, (В) Ромашки, (С) Эвкалипта.

Торможение роста клеток при различном числе впрыскиваний эфирных масел было оценено по результатам, которые сравнивались с концентрацией клеток.

100% торможение роста было выявлено при впрыскивании 100мкл эвкалиптового эфирного масла в питательный бульон. Эфирное масло ромашки подавляло рост клеток при впрыскивании более 50мкл. Когда объем впрыскиваемого масла превосходил 50мкл, оказывалось большое влияние на рост клеток. Особенно значительным было влияние на подавление роста клеток со стороны эфирного масла чайного дерева уже при впрыскивании 10мкл. Процентное торможение роста клеток достигло в течение 16 часов 100% при впрыскивании в питательный бульон 10мкл эфирного масла чайного дерева.

Торм жение роста золотистого стафилококка при введении шариков с эфирными маслами
Рост клеток в питательном бульоне был исследован при введении чистых альгинатных шариков без эфирных масел. Клетки постепенно росли в питательном бульоне на протяжении 4 часов. Чистые альгинатные шарики не могли подавить рост клеток. В действительности при добавлении в питательный бульон альгинатных шариков рост клеток усилился. С увеличением введения чистых альгинатных шариков рост клеток также повышался. Было сделано предположение, что чистые альгинатные шарики возможно служат питательной средой для клеток. Рост клеток при введении альгинатных шариков с эфирными маслами в питательный бульон показан на рисунке 3.



Рис.3. Вариации концентрации золотистого стафилококка при введении альгинатных шариков с эфирными маслами в 100мл питательного бульона. Эфирные масла (А) чайного дерева, (В) ромашки, (С) эвкалипта.

Каждое загруженное количество эфирных масел в шарики представлено в скобках на условных обозначениях рисунка. Эффект подавления роста не был выявлен при введении шариков с эфирным маслом эвкалипта в количестве менее 1г (рис.3С). Напротив клетки начинали хорошо расти, используя альгинатные шарики как питательную среду.

Рост клеток начинал подавляться при введении шариков, превышающих по весу 1,5г. 100% подавление роста клеток наступало после введения 2г шариков. Загруженное количество эфирного масла эвкалипта в шарики составило около 19мкл при 100% подавлении роста.

Антибактериальная активность ромашки начинала проявляться при введении 0,3г шариков (рис.3В). При введении 0,5г шариков с эфирным маслом, рост клетки подавляется постепенно после 20 часов. Рост клетки подавляется при введении шариков в количестве 0,8г с эфирным маслом ромашки. Количество эфирного масла ромашки в шариках составляет около 8мкл при 100% торможении роста.

Эффект угнетения роста клеток от шариков с эфирным маслом чайного дерева проявляется при введении шариков весом более 0,5г в раствор питательного бульона (рис.3А). 100% угнетение роста достигается при введении 1г шариков. Содержание эфирного масла чайного дерева в шариках составило около 5,7мкл при 100% угнетении роста.

Количество эфирного масла в альгинатных шариках при 100% угнетении роста клеток показано в таблице 2.

Таблица 2. Количество вводимых шариков с эфирными маслами и количество эфирных масел в шариках для 100% ингибирования роста золотистого стафилококка



Количество эфирных масел, загружаемых в шарики при 100% подавлении роста, оказалось меньше, чем чистые эфирные масла. С другой стороны, антибактериальная активность эфирного масла, загруженного в альгинатные шарики выше, чем активность чистого эфирного масла.

Можно предположить, что клетки могут абсорбироваться на шариках, а затем абсорбированные клетки могут вступать в реакцию с эфирным маслом, загруженным на шарики. Следовательно, эффект ингибирования клетки может быть выше, чем при чистом эфирном масле, так как клетка, концентрированная на шариках, может вступать в реакцию с эфирными маслами. Если сравнивать эффект ингибирования роста клетки при воздействии эфирных масел, то высокая антибактериальная активность эфирных масел проявляется в порядке убывания по схеме Чайное дерево>Ромашка>Эвкалипт.

Связь золотистого стафилококка с лигандами эфирных масел
ППР сенсограммы, полученные экспериментальным путем и из симуляции связи золотистого стафилококка с лигандами эфирных масел, показаны на рис.4.



Рис.4. Экспериментальная и смоделированная ППР сенсограмма связи золотистого стафилококка с лигандами эфирных масел для эфирного масла (А) Чайного дерева, (В) Ромашки, (С) Эвкалипта.

Величина RUв ППР сенсограмме стремительно нарастает при связи клеток с лигандами эфирных масел при ранней связке, а затем достигает равновесия за менее, чем 20 минут. Смоделированные сенсограммы хорошо сочетаются с экспериментальными.
Постоянные скорости и близости при связывании клетки с лигандами эфирных масел сведены в таблицу 3.

Таблица 3. Постоянные скорости и близости при связывании золотистого стафилококка с лигандами эфирных масел



Постоянные были определены из наилучшей подстроенной кривой экспериментальных ППР сенсограмм. Кинетическая модель объясняется выше в разделе теории, который был применен для симуляции экспериментальных ППР сенсограмм. Постоянные скорости ассоциации рассчитываются по кинетической модели, полученной при ~10-13 мл/(КОЕ на секунду) к клетке (1×1010 КОЕ/мл) с лигандами эфирных масел.

Постоянная скорости ассоциации связи клетки с эфирным маслом чайного дерева была выше, чем для других эфирных масел. Близость связанной клетки с эфирным маслом чайного дерева примерно в 5 раз выше, чем для эфирного масла эвкалипта. Очевидно, что связь клеток с эфирным маслом чайного дерева намного больше, чем для других эфирных масел. В процессе связывания клеток с лигандами эфирного масла чайного дерева на только скорость ассоциации больше, но и количество связанных клеток выше, чем для других эфирных масел.
Важной характеристикой эфирных масел и их компонентов является их гидрофобность, что позволяет им разделяться в липидах бактериальных клеточных мембран и митохондрий, нарушая их структуру и делая их более проницаемыми. Затем может произойти утечка ионов и других клеток. Хотя определенное количество утечки из бактериальных клеток может оказаться толерантным без потери жизнеспособности, подавляющее большинство потерь клеточного содержания или выхода критических молекул и ионов ведет к гибели клеток.

Имеются некоторые свидетельства исследований о связи эфирного масла чайного дерева и кишечной палочки, что ведет к гибели клетки до лизиса. Гидрофобность явилась движущей силой, ведущей к взаимодействию между β-амилоидом (Аβ) и клетками. В наших результатах это означает, что гидрофобность эфирных масел играет важную роль в определении связывающих взаимодействий между эфирными маслами и клетками.

Перевод Гюляра Ваидова
Источник

Любое копирование ЗАПРЕЩЕНО!
  • Антибактериальная активность эфирных масел в отношении роста золотистого стафилококка и измерение их взаимодействия в связке с использованием оптических биосенсоров

Рекомендуемые товары

- +
65рублей

Теги: ароматерапия, эфирное масло, исследование,